کلونینگ ژن رتپلاز در پلاسمید ‭pMIB/V5 5His‬ وارزیابی بیان این پروتئین در سلولهای حشره

منو

" کلونینگ ژن رتپلاز در پلاسمید ‭pMIB/V5 5His‬ وارزیابی بیان این پروتئین در سلولهای حشره "
/سارا افلاکیان ؛ حمید میر محمد صادقی، محمد علی شکرگزار، محمد ربانی

نام مرکز	:	دانشگاه علوم پزشکی اصفهان
نوع مدرک	:	پایان نامه فارسی
زبان مدرک	:	فارسی
شماره رکورد	:	101346
شماره مدرک	:	‭ت۱۳۷۰۶‬
شماره راهنما	:	‭QU،۱۴۲،‮الف‬۶۶۴ک،۱۳۹۱‬
سرشناسه	:	افلاکیان، سارا
عنوان	:	کلونینگ ژن رتپلاز در پلاسمید ‭pMIB/V5 5His‬ وارزیابی بیان این پروتئین در سلولهای حشره [پایان‌نامه]
نویسنده	:	/سارا افلاکیان
استاد راهنما	:	؛ حمید میر محمد صادقی، محمد علی شکرگزار، محمد ربانی
محل تحصیل	:	دانشکده داروسازی و علوم دارویی
سال تحصیل	:	، ‭۱۳۹۱‬
مقطع تحصیلی	:	رشته داروسازی، دکترای عمومی
تاریخ دفاع	:	‭1391/08/24‬
صفحه شمار	:	‮x، ‭۹۸‬ ص.‬: مصور، جدول
يادداشت	:	این یک پایان نامه تحقیقاتی به شماره‭ ۳۸۹۴۹۳ ‬است
يادداشت	:	چاپی
چکيده	:	رتپلاژ یک عامل قوی لیز کننده لخته می باشد که به طور وسیع در کنترل و درمان بیماری های ترومبوتیک مثل سکته مغزی و یا سکته قلبی به کار برده می شود. این فعال کننده پلاسمینوژن نوترکیب یک پروتئین تک رشته‌ای با‭ ۳۵۵ ‬آمینواسید و وزن مولکولی‭ ۳۹ ‬کیلو دالتون شامل دامین های کرینگل‭ ۲ ‬وپروتئازی ‭tpa‬ می باشد. با توجه به معایب و هزینه های بیان رتپلاز در سیستم های پروکاریوتی و گزارشات موجود از بیان موفق ‭tpa‬ در سیستم با کولوویروس و سلول های حشره در مطالعه حاضر اقدام به بررسی امکان بیان این پروتئین در سیستم بیانی غیر ویروسی حشره نمودیم. در ابتدا توالی کد کننده ژن رتپلاز با استفاده از پرایمر های طراحی شده با تکنیک ‭PCR‬ تکثیر شد و پس از برش با دو آنزیم ‭HindIII‬ و ‭XHOi‬ این قطعه به داخل پلاسمید ‭pMIB/V5-His‬ که توسط همین دو آنزیم برش داده شده بود کلون گردید. سپس پلاسمید نو ترکیب با استفاده از عامل ترانسفکشن ‭ceIIfectionII‬ به داخل سلول حشره رده سلولی ‭sf9‬ ترانسفکت شد و سپس سلول ها در معرض محیط کشت حاوی‭ ۸۰ ‬میکروگرم در میلی لیتر آنتی بیوتیک بلاستسیدین قرار گرفتند و رده های سلولی مقاوم انتخاب شدند. سپس با آنالیز دات- بلات رده سلولی مقاوم تولید کننده رتپلاز انتخاب شد و برای تایید ژن رتپلاز تکنیک وسترن - بلات بکار رفت. در نهایت فعالیت بیولوژیکی پروتئین بیان شده اندازه گیری شد. الکتروفوز محصول ‭PCR‬ باندی در حدود‭ ۱۱۰۰ ‬جفت باز نشان داد که تایید کننده صحت تکثیر ژن بود. صحت کلونینگ با آزاد شدن‭ ۲ ‬قطعه‭ ۱۱۰۰ ‬و‭ ۳۵۰۰ ‬جفت باز به دنبال برش با آنزیم های اندونوکلئاز ‭HindIII‬ ، ‭Xhol‬ تایید شد و نهایتا تعیین توالی ‭DNA‬ صحت کلونینگ را اثبات کرد. ارزیابی اولیه محیط کشت تغلیظ شده کلونهای سلولی مجزای مقاوم توسط آنالیز دات - بلات توانایی بیان رتپلاز توسط برخی از این کلون ها تایید نمود و سپس باند حدود‭ ۴۵ ‬کیلو دالتون در نتیجه آنالیز وسترن -بلات بیان ژن را تایید نمود. فعالیت بیولوژیکی رتپلاز بیان شده در حدود‭ ۲۹ ‬واحد بین المللی در میلی لیتر گزارش شد که تقریبا مشابه استاندارد کیت و بیان کننده صحت بیان پروتئین بود. در محدوده اطلاعات ما،این مطالعه اولین گزارش از بیان رتپلاز در سیستم غیر ویروسی سلول حشره می باشد. با در نظر گرفتن توانایی این سیستم برای بیان و ترشح رتپلاز واجد فعالیت بیولوژیکی، پیشنهاد می شود که در مراحل بعدی مطالعه، با بهینه سازی شرایط بیان، بازده تولید افزایش یابد
توصیفگر	:	۱. فعال کننده‌های پلاسمینوژن.- کلیدواژه‌ها: فعال کننده‌های پلاسمینوژن
	:	داروهای حلال لخته
	:	ترومبوآمبولی
	:	آنزیم ها
	:	بیان ژنی
	:	پروتئین ها
	:	Plasminogen Activators
	:	Thromboembolism
	:	Fibrinolytic Agents
	:	Enzymes
	:	Gene Expression
	:	Proteins
شناسه افزوده	:	میر محمد صادقی،حمید، استاد راهنما
	:	شکرگزار،محمد علی، استاد راهنما
	:	ربانی،محمد، استاد راهنما
شناسه افزوده	:	دانشکده داروسازی و علوم دارویی