بررسی تاثیر شرایط مختلف محیط کشت در بهینه‌سازی تولید ‭hIFN-B‬ در سلولهای ‭CHO- DHFR‬

منو

" بررسی تاثیر شرایط مختلف محیط کشت در بهینه‌سازی تولید ‭hIFN-B‬ در سلولهای ‭CHO- DHFR‬ "
/ناهید القاصی ؛ حسن کربکندی، بتول هاشمی‌بنی ؛ زهره حجتی

نام مرکز	:	دانشگاه علوم پزشکی اصفهان
نوع مدرک	:	پایان نامه فارسی
زبان مدرک	:	فارسی
شماره رکورد	:	101421
شماره مدرک	:	‭ت۱۳۵۷۱‬
شماره راهنما	:	‭QW،۸۰۰،‮الف‬۷۳۲ب،۱۳۹۱‬
سرشناسه	:	القاصی، ناهید
عنوان	:	بررسی تاثیر شرایط مختلف محیط کشت در بهینه‌سازی تولید ‭hIFN-B‬ در سلولهای ‭CHO- DHFR‬ [پایان‌نامه]
نویسنده	:	/ناهید القاصی
استاد راهنما	:	؛ حسن کربکندی، بتول هاشمی‌بنی
استاد مشاور	:	؛ زهره حجتی
محل تحصیل	:	دانشکده پزشکی
سال تحصیل	:	، ‭۱۳۹۱‬
مقطع تحصیلی	:	رشته زیست فن‌آوری پزشکی، کارشناسی ارشد
صفحه شمار	:	‮ط،‭۵۹‬ ،‭۲۰‬ ص.‬: جدول، نمودار
يادداشت	:	این یک پایان‌نامه تحقیقاتی به شماره‭ ۳۹۰۵۱۳ ‬می‌باشد
يادداشت	:	چاپی
چکيده	:	تقویت بیان پروتئین‌های نوترکیب در سل لاین‌های ترانسفکت شده برای توسعه ‭bioprocess‬ موثر در مقیاس بزرگ ضروری است. بهینه‌سازی تولید اینترفرون بتا در سلول‌های ‭CHO‬ به عنوان یک میزبان بیانی که قادر به تولید پروتئین دارویی با کیفیت بالا می‌باشد، جهت کاهش قیمت تمام شده این پروتئین نوترکیب دارویی از اهمیت زیادی برخوردار است. هدف از این تحقیق بررسی تاثیر شرایط مختلف محیط کشت شامل‭ ۴ ‬فاکتور سدیم بوتیرات، سولفات روی، اسمولالیته و دما در بهینه‌سازی تولید ‭hIFN-B‬ در سلولهای ‭CHO-DHFR‬ بود. از پلاسمید حاوی ژن اینترفرون بتای انسانی که توالی ‭Koak‬ برای بهبود بیان ژن به آن اضافه شده بود استفاده گردید این پلاسمید در باکتری ‭E.coli -XL blue‬ ترانسفورم گردید و تکثیر داده شد. پلاسمیدها با استفاده از کیت ‭Genetbio (K-1000)‬ استخراج گردیدند و غلظت و خلوص آنها بوسیله نانو اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. سلول‌های ‭CHO-HFR‬ از انستیتو پاستور خریداری شدند و در محیط کشت ‭DMEM High Glucose‬ حاوی متوتروکسات، هیپوگزانتین و تیمیدین که به آن ‭FSB‬ و استرپتومایسین و پنی‌سیلین اضافه شده بود کشت داده شدند این سلولها با پلاسمیدهای مذکور و با استفاده از کیت ‭Express in(ETR4621)‬ ترانسفکت شدند.‭ ۴ ‬عامل بر اساس منابع بیشترین تاثیر را در تولید اینترفرون بتا داشتند به روش کسری از فاکتوریل کامل تاگوچی و به وسیله نرم‌افزار ‭Minitab 16‬ به گونه‌ای مورد طراحی آزمایش قرار گرفتند که با انجام‭ ۹ ‬آزمایش تجربی بتوان به جای‭ ۸۱ ‬آزمایش، ترکیب بهینه آنها برای تولید حداکثر را بدست آورد‭ ۹ ‬محیط کشت مختلف با شرایط طراحی شده ساخته‌شدند و سلول‌های ترانسفکت شده در آنها کشت داده شد. میزان فرم فعال اینترفرون بتای انسانی تولید شده در هر‭ ۹ ‬محیط کشت و شرایط به وسیله‭ELISA(Invitrogene KAC 1201)‬ تعیین گردید و اعداد به دست آمده وارد نرم‌افزار گردید و نرم‌افزار ترکیب بهینه را اعلام نمود. ترکیب پیشنهادی توسط آزمایش تجربی تایید گردید. اثرات هر کدام از کشت‌ها بر روی تکثیر و فعالیت سلولی به روش ‭MTT assay‬ اندازه‌گیری گردید. پلاسمید حاوی ژن اینتر فرون بتای انسانی با موفقیت تکثیر گردید و در سلول‌های ‭CHO‬ ترانسفورم شد. بهترین ترکیب عوامل مهم در کشت سلول‌های ترانسفکت شده برای تولید حداکثر غلظت اینترفرون بتا با استفاده از روش تاگوچی به شرح زیر بود: سدیم بوتیرات (۳‭(mM‬، سولفات روی‭(mM۱۲۵)‬، دما‭۳۰)‬درجه سانتیگراد)، اسمولالیته ‭(mosm/kg۵۰۰)‬ بر اساس خروجی برنامه رتبه تاثیرگذاری این متغیرها به ترتیب شامل غلظت سدیم بوتیرات، غلظت سولفات روی، اسمولالیته و دما بود. همه محیط کشت‌ها و شرایط آزمایش شده به غیر از محیط کشت استاندارد معرفی شده از طرف کلکسیون سلولی شوکی به سلول‌ها وارد می‌کردند و فعالیت سلول‌ها و زنده ماندن آنها را کاهش می‌داند میزان ‭viability‬ سلولها در کشت بهینه‭ ۵۱ ‬درصد بود
توصیفگر	:	۱. اینترفرون ها.- کلیدواژه‌ها: اینترفرون‌ها
	:	محیط کشت
	:	انتقال ژن
	:	پروتئین‌های بهم پیوسته نوترکیب
	:	Interferons
	:	Culture Media
	:	Transfection
	:	Recombinant Fusion Protein
شناسه افزوده	:	کربکندی، حسن، استاد راهنما
	:	هاشمی‌بنی، بتول، استاد راهنما
	:	حجتی، زهره، استاد مشاور
شناسه افزوده	:	دانشکده پزشکی