بررسی توانایی وکتورهای انتی ویروسی ناقص از نظر آنزیم های رونوشت بردای معکوس و اینتگراز در بیان ترانس...

منو

" بررسی توانایی وکتورهای انتی ویروسی ناقص از نظر آنزیم های رونوشت بردای معکوس و اینتگراز در بیان ترانس ژن در رده سلولی‭۲۹۳T ‬ "
/آرزو کرم زاده ؛ حسین خان احمد ؛ رسول صالحی

نام مرکز	:	دانشگاه علوم پزشکی اصفهان
نوع مدرک	:	پایان نامه فارسی
زبان مدرک	:	فارسی
شماره رکورد	:	102029
شماره مدرک	:	‭ت۱۴۶۳۹‬
شماره راهنما	:	‭WC،۵۰۳/۲،ک۴۶۶ب،۱۳۹۲‬
سرشناسه	:	کرم‌زاده، آرزو
عنوان	:	بررسی توانایی وکتورهای انتی ویروسی ناقص از نظر آنزیم های رونوشت بردای معکوس و اینتگراز در بیان ترانس ژن در رده سلولی‭۲۹۳T ‬ [پایان‌نامه]
نویسنده	:	/آرزو کرم زاده
استاد راهنما	:	؛ حسین خان احمد
استاد مشاور	:	؛ رسول صالحی
محل تحصیل	:	دانشکده پزشکی
سال تحصیل	:	، ‭۱۳۹۲‬
مقطع تحصیلی	:	رشته ژنتیک انسانی، کارشناسی ارشد
صفحه شمار	:	‮ح، ‭۹۸‬ ص.‬: مصور، جدول، نمودار
يادداشت	:	این یک پایان نامه تحقیقاتی با شماره‭ ۳۹۱۳۳۵ ‬است
يادداشت	:	چاپی
چکيده	:	یکی از راهکارهای ژن درمانی عفونت ‭HIV-1‬ کشتن سلول های آلوده به ویروس با استفاده از ژن های خودکشنده است. اما چالش مهم در این روش منحصر کردن بیان ژن خودکشنده در این سلول هاست. راه حلی که برای این مشکل پیشنهاد می شود آن است که با حذف توالی ژنی دومن ‭RNase H‬ از آنزیم رونوشتت بردار معکوس و آنزیم اینتگراز با یا بدون جهش دومن ‭P51‬ (تبدیل تریژتوفان‭ ۲۲۹ ‬به لیزین) از ناقل ‭Plp1‬ یکی از سه ناقل کمکی در ساخت وکتورهای لنتی ویروسی نسل سوم لنتی وکتوری ناقصی از نظر آزیم های اینتگراز و رونوشت بردار معکوس ساخته شود. انتظار می رود این وکتورها از این دو آنزیم که تنها در سلول های آلوده به ویروس ‭HIV-1‬ وجود دارد برای تبدیل ‭RNA‬ ژنومی خود به ‭DNA‬ درج آن و در نتیجه بیان ژن خودکشنده و کشتن اختصاصی این سلول ها استفاده کنند. در مطالعه حاضر توانایی تولید جنین لنتی وکتور ناقصی از نظر آنزیم های اینتگراز و رونوشت برادار معکوس بررسی شد. قطعه ‭P51‬ جهش یافته و قطعه ‭P51‬ به ترتیب با روش ‭Overlap extgension PCR‬ و ‭CRP‬ تکثیر شدند ساخت دو نوع پلاسمید ‭pLP1‬ جهش یافته با کلون کردن هر یک از این قطعات در پلاسمید ‭pLP1‬ فاقد ژن اینتگراز و ‭RNASE H‬ انجام شد. تولید وکتور لنتی ویروسی با ترانسفکشن همزمان ناقل ‭plenti-DEST‬ به همراه ناقل های کمکی ‭pLP2, pLP/VSV-G, pLP1‬ ب‌ه روش ک‌لسیم- فسفات به درون رده سلولی ‭T293‬ صورت گرفت پس از استخراج ‭RNA‬ ویروس و سنتز ‭cDNA‬ با تکنیک ‭Absolute Real-time PCR‬ تیتر وکتورهای لنتی ویروسی ناقص و طبیعی مورد بررسی قرار گرفت همچنین بیان ژن ‭eGFP‬ بعد از ترانسداکشن حجم های متفاوت ‭ ۴ ،۱۶ ،۶۴ ،۱۲۸)‬و‭ ۱ ‬میکرولیتر) از سوپ تغلیظ شده ویروس ها در سلول های ‭T293‬ با میکروسکوپ فلورسانس بررسی شد. تیتر لنتی وکتورهای طبیعی محاسبه شد و هیچ یک از لنتی وکتورهای ناقص طراحی شده در این مطالعه تکثیری نداشنند. همچنین برخلاف لنتی وکتورهای طبیعی که بین افزایش غلظت ویروس و درصد سلول های ‭T293‬ سبز شده ارتباط مستقیم وجود داشت. وکتورهای لنتی ویروسی ناقص هیچ بیانی از ژن ‭eGFP‬ نشان ندادند که همراه با نتایج حاصل از ‭Real-time‬ بیانگر عدم تولید این وکتورها در این مطالعه بود. دلایل احتمالی عدم موفقیت در تولید وکتورهای لنتی ویروسی ناقص می تواند این باشد که مطالعاتی با حذف های مشابه این تحقیق که موفق به تولید لنتی ویروس های ناقص شده بودند از وکتور‭pNL4-3‬ که حاوی توالی کامل ژنوم ویروس ‭HIV-1‬ و ژن های ویرولانس بود، استفاده کرده نمودند، بر خلاف وکتورهای لنتی ویروسی نسل سه که برای ساختشان نیازمند سه پلاسمید مجزا هستند. این مطالعات همچنین با کاهش تیتر‭ ۳۰-۷۰ ‬درصد لنتی ویروسهای حاصل از حذف همزمان دومن های اینتگراز و ‭RNase H‬ مواجه شدند با توجه به این که لنتی وکتورهای نسل سه از تیتر پایینی برخوردارند حال با افزودن دو نقص آنزیمی مذکورچه بسا تیتر این وکتورها نیز چنان کاهشی پیدا کرده است. که غیر قابل تیتراسیون هستند. از طرفی شاید همچون‭Integrase-deficient leniviral vectors (IDLVs)‬ تنها گروه خاصی که از جهش ها در تولید لنتی ویرال وکتور ناقص از نظر آنزیم های رونوشت بردار معکوس و اینتگراز کاربردی بوده و حذف های ژنی انجام شده در این مطالعه در دسته جهش های ممانعت کننده از ساخت وکتور محسوب می شوند. در آخر پیش بینی می شود که شاید با افزایش تیتر تولیدی وکتورهای لنتی ویروسی طبیعی تا‭ ۱۰ ‬به توان‭TU/ml ۶ ‬ و یا بیشتر امکان تولید چنین وکتورهای ناقصی وجود داشته باشد.
توصیفگر	:	۱- ژن درمانی.- کلیدواژه‌ها: ژن درمانی
	:	اچ آی وی - ۱
	:	عفونت های اچ آی وی - ۱
	:	Gene Therapy
	:	HIV-1
	:	HIV-1 infections
شناسه افزوده	:	خان‌احمد، حسین، استاد راهنما
	:	صالحی، رسول، استاد مشاور
شناسه افزوده	:	دانشکده پزشکی